новости

В последнее десятилетие технология секвенирования генов широко применяется в онкологических исследованиях и клинической практике, став важным инструментом для выявления молекулярных характеристик рака. Достижения в области молекулярной диагностики и таргетной терапии способствовали разработке концепций прецизионной терапии опухолей и внесли существенные изменения во всю область диагностики и лечения опухолей. Генетическое тестирование может использоваться для предупреждения риска развития рака, принятия решений о лечении и оценки прогноза, а также является важным инструментом для улучшения клинических результатов лечения пациентов. Здесь мы обобщаем недавние статьи, опубликованные в журналах CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol и других, чтобы рассмотреть применение генетического тестирования в диагностике и лечении рака.

Соматические мутации и мутации в зародышевой линии. Как правило, рак вызывается мутациями ДНК, которые могут быть унаследованы от родителей (мутации зародышевой линии) или приобретены с возрастом (соматические мутации). Мутации в зародышевой линии присутствуют с рождения, а мутатор обычно несет мутацию в ДНК каждой клетки организма и может передаваться потомству. Соматические мутации приобретаются человеком в негаметных клетках и обычно не передаются потомству. Как зародышевые, так и соматические мутации могут нарушить нормальную функциональную активность клеток и привести к их злокачественной трансформации. Соматические мутации являются ключевым фактором злокачественности и наиболее предиктивным биомаркером в онкологии; однако примерно у 10–20% пациентов с опухолями имеются мутации в зародышевой линии, которые значительно повышают риск развития рака, и некоторые из этих мутаций также являются терапевтическими.
Мутации-драйверы и мутации-пассажиры. Не все варианты ДНК влияют на функцию клеток; в среднем для запуска нормальной клеточной дегенерации требуется от пяти до десяти геномных событий, известных как «драйверные мутации». Драйверные мутации часто возникают в генах, тесно связанных с жизнедеятельностью клеток, таких как гены, участвующие в регуляции роста клеток, репарации ДНК, контроле клеточного цикла и других жизненных процессах, и потенциально могут использоваться в качестве терапевтических мишеней. Однако общее число мутаций при любом раке довольно велико: от нескольких тысяч в некоторых видах рака молочной железы до более чем 100 000 в некоторых высоковариабельных видах колоректального и эндометриального рака. Большинство мутаций не имеют или имеют ограниченное биологическое значение, даже если мутация происходит в кодирующей области; такие незначительные мутационные события называются «пассажирскими мутациями». Если вариант гена в определенном типе опухоли предсказывает ее ответ на лечение или резистентность к нему, вариант считается клинически операбельным.
Онкогены и гены-супрессоры опухолей. Гены, часто мутирующие при раке, можно условно разделить на две категории: онкогены и гены-супрессоры опухолей. В нормальных клетках белок, кодируемый онкогенами, играет основную роль в стимуляции пролиферации клеток и ингибировании апоптоза, в то время как белок, кодируемый генами-онкосупрессорами, отвечает преимущественно за негативную регуляцию клеточного деления для поддержания нормального функционирования клеток. В процессе злокачественной трансформации геномные мутации приводят к усилению активности онкогенов и снижению или потере активности генов-онкосупрессоров.
Малые вариации и структурные вариации. Это два основных типа мутаций в геноме. Малые вариации изменяют ДНК путем изменения, удаления или добавления небольшого количества оснований, включая вставки, делеции, сдвиг рамки считывания, мутации с потерей стартового кодона, мутации со стоп-кодоном и т. д. Структурные вариации — это обширные перестройки генома, затрагивающие сегменты генов размером от нескольких тысяч оснований до большей части хромосомы, включая изменения числа копий генов, делеции хромосом, дупликации, инверсии или транслокации. Эти мутации могут приводить к снижению или усилению функции белка. Помимо изменений на уровне отдельных генов, геномные сигнатуры также являются частью отчетов по клиническому секвенированию. Геномные сигнатуры можно рассматривать как сложные паттерны небольших и/или структурных вариаций, включая нагрузку мутациями в опухоли (TMB), микросателлитную нестабильность (MSI) и дефекты гомологичной рекомбинации.

Клональные мутации и субклональные мутации. Клональные мутации присутствуют во всех опухолевых клетках, присутствуют на момент постановки диагноза и сохраняются после улучшения лечения. Следовательно, клональные мутации могут быть потенциально использованы в качестве терапевтических мишеней для опухолей. Субклональные мутации присутствуют только в подгруппе раковых клеток и могут быть обнаружены в начале диагностики, но исчезают при последующем рецидиве или появляются только после лечения. Гетерогенность рака относится к наличию нескольких субклональных мутаций в одном раке. Примечательно, что подавляющее большинство клинически значимых драйверных мутаций во всех распространенных видах рака являются клональными мутациями и остаются стабильными на протяжении прогрессирования рака. Резистентность, которая часто опосредована субклонами, может не быть обнаружена на момент постановки диагноза, но появляется при рецидиве после лечения.

Традиционный метод FISH, или клеточного кариотипирования, используется для выявления изменений на хромосомном уровне. FISH может использоваться для обнаружения слияний, делеций и амплификации генов и считается «золотым стандартом» для выявления таких вариантов, обеспечивая высокую точность и чувствительность, но ограниченную производительность. При некоторых гематологических злокачественных новообразованиях, особенно при остром лейкозе, кариотипирование по-прежнему используется для диагностики и прогнозирования, но этот метод постепенно вытесняется таргетными молекулярными анализами, такими как FISH, WGS и NGS.
Изменения в отдельных генах можно обнаружить с помощью ПЦР, как в реальном времени, так и цифровой капельной ПЦР. Эти методы обладают высокой чувствительностью, особенно подходят для обнаружения и мониторинга небольших остаточных поражений и позволяют получать результаты в относительно короткие сроки. Недостатком является ограниченный диапазон обнаружения (обычно выявляются только мутации в одном или нескольких генах) и ограниченная возможность проведения множественных тестов.
Иммуногистохимия (ИГХ) — это метод мониторинга на основе белков, обычно используемый для определения экспрессии таких биомаркеров, как ERBB2 (HER2) и рецепторы эстрогена. ИГХ также может использоваться для выявления специфических мутантных белков (например, BRAF V600E) и специфических слияний генов (например, слияний ALK). Преимущество ИГХ заключается в том, что его легко интегрировать в стандартный процесс анализа тканей, что позволяет комбинировать его с другими исследованиями. Кроме того, ИГХ может предоставить информацию о субклеточной локализации белков. Недостатками метода являются ограниченная масштабируемость и высокие организационные требования.
Секвенирование второго поколения (NGS). NGS использует высокопроизводительные методы параллельного секвенирования для выявления вариаций на уровне ДНК и/или РНК. Этот метод позволяет секвенировать как весь геном (WGS), так и интересующие участки генов. WGS обеспечивает наиболее полную информацию о геномных мутациях, но существует множество препятствий для его клинического применения, включая необходимость использования свежих образцов опухолевой ткани (WGS пока не подходит для анализа образцов, иммобилизованных в формалине) и высокую стоимость.
Целевое секвенирование NGS включает в себя секвенирование целых экзонов и панель целевых генов. Эти тесты обогащают интересующие регионы с помощью ДНК-зондов или ПЦР-амплификации, тем самым ограничивая объем необходимого секвенирования (весь экзом составляет 1-2% генома, и даже большие панели, содержащие 500 генов, составляют лишь 0,1% генома). Хотя секвенирование целых экзонов хорошо работает в фиксированных формалином тканях, его стоимость остается высокой. Комбинации целевых генов относительно экономичны и обеспечивают гибкость в выборе генов для тестирования. Кроме того, циркулирующая свободная ДНК (cfDNA) становится новым вариантом для геномного анализа онкологических пациентов, известного как жидкая биопсия. Как раковые, так и нормальные клетки могут выделять ДНК в кровоток, и ДНК, выделяемая раковыми клетками, называется циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA), которую можно анализировать для выявления потенциальных мутаций в опухолевых клетках.
Выбор метода исследования зависит от конкретной клинической проблемы, которую необходимо решить. Большинство биомаркеров, связанных с одобренными методами лечения, можно обнаружить с помощью методов FISH, IHC и ПЦР. Эти методы подходят для обнаружения небольших количеств биомаркеров, но они не повышают эффективность обнаружения с увеличением пропускной способности, и если обнаружено слишком много биомаркеров, ткани может быть недостаточно для обнаружения. В случае некоторых видов рака, таких как рак лёгких, когда образцы ткани получить сложно, а для исследования требуется несколько биомаркеров, предпочтительным вариантом является NGS. В заключение, выбор метода исследования зависит от количества биомаркеров, которые необходимо протестировать у каждого пациента, и количества пациентов, которых необходимо протестировать на биомаркер. В некоторых случаях достаточно использования IHC/FISH, особенно при наличии определённой мишени, например, при обнаружении рецепторов эстрогена, рецепторов прогестерона и ERBB2 у пациентов с раком молочной железы. Если требуется более комплексное исследование геномных мутаций и поиск потенциальных терапевтических мишеней, NGS более организован и экономически эффективен. Кроме того, NGS может быть рассмотрен в случаях, когда результаты ИГХ/FISH неоднозначны или неубедительны.

Различные руководства содержат рекомендации относительно того, каким пациентам следует проводить генетическое тестирование. В 2020 году рабочая группа ESMO по прецизионной медицине опубликовала первые рекомендации по NGS-тестированию для пациентов с распространенным раком, предложив рутинное NGS-тестирование для образцов опухолей распространенного неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого, рака предстательной железы, колоректального рака, рака желчных протоков и рака яичников. В 2024 году ESMO обновило рекомендации на этой основе, рекомендовав включить в исследование рак молочной железы и редкие опухоли, такие как гастроинтестинальные стромальные опухоли, саркомы, рак щитовидной железы и рак неизвестного происхождения.
В 2022 году в клиническом заключении ASCO по поводу соматического геномного тестирования у пациентов с метастатическим или распространенным раком указано, что если терапия, связанная с биомаркерами, одобрена для пациентов с метастатическими или распространенными солидными опухолями, таким пациентам рекомендуется генетическое тестирование. Например, геномное тестирование следует проводить у пациентов с метастатической меланомой для скрининга мутаций BRAF V600E, поскольку ингибиторы RAF и MEK одобрены для этого показания. Кроме того, генетическое тестирование следует проводить при наличии четкого маркера резистентности к препарату, который будет назначен пациенту. Например, Egfrmab неэффективен при колоректальном раке с мутацией KRAS. При рассмотрении возможности проведения секвенирования гена необходимо учитывать физическое состояние пациента, сопутствующие заболевания и стадию опухоли, поскольку последовательность этапов, необходимых для секвенирования генома, включая согласие пациента, лабораторную обработку и анализ результатов секвенирования, требует от пациента адекватной физической подготовки и ожидаемой продолжительности жизни.
Помимо соматических мутаций, некоторые виды рака также требуют тестирования на наличие генов зародышевой линии. Тестирование на наличие мутаций в генах зародышевой линии может повлиять на выбор метода лечения таких видов рака, как мутации BRCA1 и BRCA2 при раке молочной железы, яичников, предстательной железы и поджелудочной железы. Мутации зародышевой линии также могут иметь значение для будущего скрининга и профилактики рака у пациентов. Пациенты, которые потенциально подходят для тестирования на наличие мутаций в генах зародышевой линии, должны соответствовать определенным условиям, которые включают такие факторы, как семейный анамнез рака, возраст на момент постановки диагноза и тип рака. Однако многие пациенты (до 50%), несущие патогенные мутации в генах зародышевой линии, не соответствуют традиционным критериям тестирования на наличие мутаций в генах зародышевой линии, основанным на семейном анамнезе. Поэтому для максимального выявления носителей мутаций Национальная комплексная онкологическая сеть (NCCN) рекомендует, чтобы все или большинство пациентов с раком молочной железы, яичников, эндометрия, поджелудочной железы, колоректальным раком или раком предстательной железы прошли тестирование на наличие мутаций в генах зародышевой линии.
Что касается сроков проведения генетического тестирования, то, поскольку подавляющее большинство клинически значимых драйверных мутаций являются клональными и относительно стабильны в ходе прогрессирования рака, целесообразно проводить генетическое тестирование пациентов на момент постановки диагноза запущенного рака. Для последующего генетического тестирования, особенно после молекулярно-таргетной терапии, тестирование цоДНК более предпочтительно, чем ДНК опухолевой ткани, поскольку ДНК крови может содержать ДНК из всех опухолевых очагов, что позволяет лучше получить информацию о гетерогенности опухоли.
Анализ ctDNA после лечения может быть полезен для прогнозирования ответа опухоли на лечение и выявления прогрессирования заболевания раньше, чем стандартные методы визуализации. Однако протоколы использования этих данных для принятия решений о лечении не разработаны, и анализ ctDNA не рекомендуется применять, за исключением клинических исследований. ctDNA также может использоваться для оценки небольших остаточных очагов после радикальной операции по удалению опухоли. Анализ ctDNA после операции является надежным предиктором последующего прогрессирования заболевания и может помочь определить, принесет ли пациенту пользу адъювантная химиотерапия, однако использовать ctDNA вне клинических исследований для принятия решений о назначении адъювантной химиотерапии по-прежнему не рекомендуется.

Обработка данных. Первым этапом секвенирования генома является извлечение ДНК из образцов пациентов, подготовка библиотек и получение первичных данных секвенирования. Первичные данные требуют дальнейшей обработки, включая фильтрацию низкокачественных данных, сравнение с референтным геномом, выявление различных типов мутаций с помощью различных аналитических алгоритмов, определение влияния этих мутаций на трансляцию белков и фильтрацию мутаций зародышевой линии.
Аннотация гена-драйвера предназначена для различения мутаций драйвера и пассажира. Мутации драйвера приводят к потере или усилению активности гена-супрессора опухоли. Небольшие варианты, которые приводят к инактивации гена-супрессора опухоли, включают в себя нонсенс-мутации, мутации со сдвигом рамки считывания и мутации ключевых участков сплайсинга, а также менее частые делеции стартового кодона, делеции стоп-кодона и широкий спектр мутаций вставки/делеции интрона. Кроме того, миссенс-мутации и небольшие мутации вставки/делеции интрона также могут приводить к потере активности гена-супрессора опухоли, затрагивая важные функциональные домены. Структурные варианты, которые приводят к потере активности гена-супрессора опухоли, включают частичную или полную делецию гена и другие геномные варианты, которые приводят к разрушению рамки считывания гена. Небольшие варианты, которые приводят к усилению функции онкогенов, включают в себя миссенс-мутации и случайные вставки/делеции интронов, которые нацелены на важные функциональные домены белка. В редких случаях усечение белка или мутации в месте сплайсинга могут привести к активации онкогенов. Структурные изменения, приводящие к активации онкогенов, включают слияние, делецию и дупликацию генов.
Клиническая интерпретация геномных вариаций оценивает клиническую значимость выявленных мутаций, то есть их потенциальную диагностическую, прогностическую или терапевтическую ценность. Существует несколько систем оценки, основанных на фактических данных, которые можно использовать для клинической интерпретации геномных вариаций.
База данных онкологии прецизионной медицины (OncoKB) Мемориального онкологического центра имени Слоуна-Кеттеринга классифицирует генные варианты по четырём уровням в зависимости от их прогностической ценности для применения лекарственных препаратов: Уровень 1/2 – одобренные FDA или клинически стандартные биомаркеры, прогнозирующие ответ на одобренный препарат по определённому показанию; Уровень 3 – одобренные FDA или не одобренные биомаркеры, прогнозирующие ответ на новые таргетные препараты, показавшие многообещающие результаты клинических испытаний; и Уровень 4 – не одобренные FDA биомаркеры, прогнозирующие ответ на новые таргетные препараты, показавшие убедительные биологические доказательства в клинических испытаниях. Была добавлена ​​пятая подгруппа, связанная с резистентностью к терапии.
Руководящие принципы Американского общества молекулярной патологии (AMP)/Американского общества клинической онкологии (ASCO)/Колледжа американских патологов (CAP) по интерпретации соматической вариабельности подразделяют соматическую вариабельность на четыре категории: степень I – с выраженной клинической значимостью; степень II – с потенциальной клинической значимостью; степень III – клиническая значимость неизвестна; степень IV – клиническая значимость неизвестна. Только варианты степени I и II имеют ценность для принятия решений о лечении.
Шкала клинической эффективности молекулярной целевой терапии (ESCAT) ESMO классифицирует варианты генов по шести уровням: Уровень I — целевые терапии, пригодные для рутинного использования; Фаза II — целевая терапия, которая всё ещё изучается, вероятно, будет использоваться для скрининга популяции пациентов, которым может быть полезен целевой препарат, но для её обоснования необходимы дополнительные данные. Уровень III — целевые варианты генов, продемонстрировавшие клиническую эффективность при других видах рака; Уровень IV — только целевые варианты генов, подтверждённые доклиническими данными; Уровень V — имеются доказательства, подтверждающие клиническую значимость таргетной терапии мутации, но терапия одним препаратом против целевой терапии не увеличивает выживаемость, или может быть применена комбинированная стратегия лечения; Уровень X — отсутствие клинической ценности.